Purificación de Oligonucleótidos por PAGE

Preparación de 100 mL de Solución Stock de
Acrilamida al 15% y 7M de Urea

  1. Mezclar en un vaso de precipitados de 250mL:
    • 14.25g de Acrilamida
    • 0.75g de Bisacrilamida
    • 42g de Urea
    • 10mL de Buffer TBE10X
    • 46mL de Agua mQ
  2. Disolver con agitación magnética
  3. Filtrar la solución para eliminar partículas insolubles
  1. Preparar un gel de acrilamida mezclando 15mL de la solución stock, 60uL de Persulfato de Amonio al 10% y 12uL de TEMED en una cámara de electroforesis tipo "Tall mighty" con separadores de 1.5mm y peine de 5 pozos del mismo grosor. Cada pozo debe tener un ancho y altura de 13 mm. El proceso de gelificación toma aproximadamente 5 a 10 min.
    NOTA: Para oligos de longitudes mayores a 45 nucleótidos la concentración de la acrilamida deberá ser de 12% y para oligos mayores de 65 deberá ser de 10% conservando la proporción 19:1/acrilamida:bisacrilamida
  2. Precorrer el gel durante 15min a 350V, apagar la fuente de poder y lavar los pozos con el mismo buffer de corrida (TBE 1X) utilizando una jeringa de 5mL. Cargar 50ug de material (oligo crudo) por carril.
    NOTA: El volumen de muestra variará de acuerdo con la concentración del oligo, para cargar el gel se necesitan aprox. 50ul de oligo y 10ul de azul de bromofenol por carril.
  3. Correr el gel a 350V hasta que el azul de bromofenol empieze a salir por el borde inferior del gel (aprox. 1.5h).
  4. Visualizar el gel sobre una placa de silica fluorescente (de las utilizadas en cromatografía en capa fina) con luz UV de onda corta (254nm) y cortar la banda correspondiente a la longitud del oligo (generalmente la banda de mayor concentración y de menor migración).
  5. Colocar la banda en un tubo eppendorf de 1.5mL y agregar 1mL de Agua mQ estéril o hasta cubrir totalmente el trozo de gel. Incubar a 37 grados durante 12h de preferencia con agitación rotatoria.
  6. Retirar el sobrenadante y concentrar la solución hasta 200uL aprox. en un Savant con calentamiento ligero (no mayor de 40 grados) por un lapso de 2hs aprox.
  7. Agregar 1.0mL de nButanol y "vortexear" fuertemente durante 30seg. Centrifugar a 13000rpm durante 1min. Eliminar la fase superior y repetir una vez mas la extracción con nButanol. En este punto solo debe quedar un pellet transparente.
  8. Agregar 1mL de Etanol Absoluto (muy importante), agitar en Vortex y centrifugar (3min). Eliminar el sobrenadante por decantación.
  9. Secar el pellet en Savant.
  10. Disolver el pellet en 115uL de Agua mQ Estéril y medir absorbancia a 260nm. (Tomar como referencia el agua mQ que se usó para disolver. La dilución para medir absorbancia es de 5uL de oligo + 495uL de agua). El valor leido multiplicarlo por 3.3 y se obtiene la concentración en ug/uL.
En caso de existir alguna duda o de requerir asesoría, favor de dirigirse directamente a la Unidad de Síntesis y Secuenciación con el personal ahí presente

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