Diseño de Oligonucleótidos

Aunque no existe una 'regla' general, se recomienda que:

  1. Los primers no tengan ninguna discrepancia (mismatch), a exepción de los utilizados para mutagenesis.
  2. No exista algún sitio alternativo en el templado donde el primer pueda hibridarse.
  3. Los primers no formen estructura secundaria, especialmente en el extremo 3' o que sean parcialmente complementarios
  4. La longitud del oligo sea de 20 a 24 bases para reducir al mínimo la posibilidad de hibridización en sitios secundarios en el vector o inserto.
  5. La temperatura de fusión (Tm) sea de 55oC o más, de manera que este por arriba de la temperatura de "annealing".
  6. El oligo no contenga "strings" de más de una base. Es de especial importancia evitar 3 o mas G's o C's consecutivas.
  7. Los primers tengan un contenido de C/G entre 40 y 60%. Para primers con contenido menor al 50% de C/G, es necesario incrementar la secuencia de los mismos para levar la Tm sobre la temperatura de annealing.
  8. El primer sea más afín en su extremo 3'

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